胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine Base Editor, CBE)是一种革命性的基因编辑工具,由四个关键成分组成:dCas9蛋白、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶(Cytidine Deaminase)和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(Uracil DNA Glycosylase Inhibitor, UGI)。这些成分在细胞内组装成融合蛋白,通过sgRNA的引导,融合蛋白与基因组DNA特异性结合,使靶序列呈现单链结构。接着,胞嘧啶脱氨酶将单链上的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U),通过DNA复制或修复过程,这一转变最终导致C-G碱基对被直接替换为T-A碱基对。
在CBE的过程中,研究人员利用中间产物脱氧尿嘧啶(dU)的特点,开发出Detect-seq技术,该技术可用于体外检测脱靶效应。Detect-seq的主要步骤包括提取经过碱基编辑的细胞基因组DNA,并对CBE产生的dU进行生物素(biotin)标记,以便富集目标片段。同时,在dU位点的下游,将正常的胞嘧啶C替换为5-醛基胞嘧啶(d5fC),并在后续步骤中将d5fC化学标记为T。通过这种方式,研究人员能够在测序中观测到大量的C-to-T突变信号,快速定位碱基编辑的位点。
与GUIDE-seq、Digenome-seq以及Cas-OFFinder等技术相比,Detect-seq展现出更高的灵敏性和特异性,且没有偏向性。无论是Cas9依赖型还是非依赖型脱靶效应,Detect-seq均可进行有效检测,同时还能识别sgRNA结合区域的外编辑(out-of-protospacer edits)及靶向链编辑(target-stranded edits)上的脱靶效应。
在过去两年中,尊龙凯时科技构建了一站式基因编辑安全性评估平台,涵盖靶点设计、靶点筛选、GUIDE-seq脱靶检测(基于细胞的检测)、AID-seq脱靶检测(生化检测)、Detect-seq脱靶检测及脱靶验证等多种管线。此外,尊龙凯时实验室还拥有SGS认证、ISO9001质量体系认证及生物安全二级实验室等资质认证,能够持续稳定地为客户提供高效、安全和优质的服务与产品。