ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简写，是在免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的免疫酶技术，广泛应用于检测抗原或抗体浓度的生物医学实验中。
在ELISA实验中，显色是最后一步的温育反应，主要通过酶催化无色底物生成有色产物。反应的温度和时间会显著影响显色效果。在一定的时间内，阴性孔保持无色，而阳性孔的显色则随时间增加而逐渐加深。适当提高温度，可以加速显色的进程。在定量测定中，使用底物后的反应温度和时间需按照规定严格控制，而定性测定可以在室温下完成，时间也不必严格限制，依据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况调整反应时间即可。
以OPD底物为例，其显色一般在室温或37℃下反应20-30分钟后达到恒定状态，若继续延长时间，则可能导致本底值的升高。由于OPD底物液在光照下会自行变色，因此显色反应应在避光条件下进行，并在反应结束时加入终止液以停止反应。用硫酸终止OPD反应后，显色由橙黄色转变为棕黄色。
TMB底物受到光照的影响较小，可以在室温中放置进行观察。但为了确保实验结果的稳定性，建议在适当的时间内读取结果。TMB在HRP的作用下，约40分钟显色达到峰值，并在2小时后逐渐减弱至无色。TMB的终止液有多种选择，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂可有效终止反应，使得显色蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪色，是进行目视判断的良好选择。此外，各类酸性终止液会使蓝色转变为黄色，此时可使用特定波长（450nm）读取吸光值。
在检测过程中，待测标本（目标抗原）与固相载体表面的抗体发生反应。洗涤后，加入酶标记的抗体，这些抗体将通过反应结合在固相载体上。随后加入酶反应的底物，底物在酶的催化下转化为有色产物，其量与标本中待测物质的量直接相关，可以根据显色深浅进行定性或定量分析。
ELISA是生物医学研究中最常用的实验方法之一，但常会遇到一些问题。以下是一些常见的标曲和样本显色问题分析：
此情况可能由于样本显色的标准品未充分涡旋震荡导致。在溶解标准品时，需确保进行充分的涡旋震荡；在倍比稀释时也同样重要，仅依赖移液器进行操作效果会有限。
如果在孵育阶段静置在桌面上，则抗原与抗体的接触可能不足，显色会偏弱。推荐使用专用的微孔板振荡器以确保充分接触。另外，也需确保所有组分如检测抗体和酶的添加未漏掉。新手应注意做好标记和记录，或者选择带有染料的ELISA试剂盒。
许多人可能会将此归咎于试剂盒的问题，但实际上，当样本中目标蛋白浓度极低或干扰因素较强时，往往会导致检测困难。ELISA依旧是蛋白检测灵敏度最高的方法，通过与其他技术结合，出现了高敏ELISA、化学发光ELISA、荧光法ELISA等多种类型，以提高检测灵敏度。
这通常与移液器的使用及操作手法密切相关。如移液器使用不规范，或实验者的加样一致性不佳都会影响CV值。建议参阅相关移液器使用文章，正确使用和维护，同时可在空白板上练习移液动作提升精密度。
通过应用尊龙凯时等品牌的优质ELISA试剂盒和设备，可以有效提升实验的准确性和灵敏度，确保生物医学研究的有效性和可靠性。