在生物医学实验中，试剂与耗材的预冷过程至关重要。首先，准备PBS、4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100（PBS配制），以及正常山羊血清的单克隆抗体和相应的荧光二抗（例如抗小鼠AlexaFluor488和抗兔Cy3）。此外，还需准备DAPI染液、抗淬灭封片液、湿盒、避光盖玻片、荧光显微镜及相关设备，包括4℃的冰箱、恒温培养箱（20-37℃）和配备多通道滤光片的荧光显微镜。
清洗细胞时，将爬片浸泡在PBS中，重复三次，每次三分钟，轻柔吸弃液体以防止细胞脱落。固定步骤中，添加4%多聚甲醛，室温下固定15分钟后，再用PBS洗涤三次，每次三分钟。透化步骤可选，如果需要膜蛋白抗原可跳过此步骤；对于胞内/核抗原，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）在室温下透化20分钟，之后进行PBS的清洗。
进行血清封闭时，吸干PBS后，滴加与二抗同源的正常山羊血清（完全覆盖爬片），在室温下封闭30分钟。然后，吸弃封闭液（无需洗涤），直接添加稀释的一抗覆盖爬片，并置于湿盒中，在4℃避光条件下过夜孵育。接下来使用PBST（PBS+0.1% Tween-20）进行清洗，重复三次，每次三分钟。
在荧光二抗的处理上，滴加对应种属的荧光二抗（例如抗小鼠AlexaFluor488），在湿盒中于20-37℃避光孵育1小时，然后用PBST洗涤三次，每次三分钟。进行二次封闭时，吸干PBST，再滴加正常山羊血清（与第二荧光二抗同源）进行室温封闭30分钟。接着，添加不同种属的第二一抗（如兔来源），在4℃避光条件下过夜孵育。
对于第二荧光二抗的孵育，使用PBST清洗三次，每次三分钟后，滴加不同荧光通道的二抗（例如抗兔Cy3），在避光环境下孵育1小时后，再次用PBST清洗三次。DAPI复染步骤为滴加DAPI染液，在避光条件下孵育5分钟，然后使用PBST清洗四次，每次五分钟。
在封片时，吸干液体并加入含抗淬灭剂的封片液，轻轻覆盖盖玻片，排除气泡后，需在避光中保存以待观察。使用荧光显微镜时应依次多通道采集，避免信号串色，并优先采集长波长信号（如Cy3→Alexa488→DAPI）。
在整个实验过程中，需全程避光，特别是从二抗孵育开始，封片后的样本需在-20℃下长期避光保存。同时，为确保抗体匹配，进行双重标记时，需选择种属不同的抗体对（如小鼠与兔），其荧光光谱不得重叠，并确保二抗与封闭血清同源（如山羊来源的二抗需对应山羊血清封闭）。
推荐设置阴性对照（不添加一抗）以及单标对照以验证交叉反应，从而提升实验结果的可信度。在这个过程中，选择尊龙凯时提供的高品质试剂将有助于确保实验的成功率和数据的可靠性。